Анализ олигонуклеотидов методом IP-RP LC-MS: примеси и продукты деградации

Почему анализ олигонуклеотидов сложнее обычной ВЭЖХ

Синтетические олигонуклеотиды представляют собой последовательности нуклеотидов DNA, RNA или их химически модифицированных аналогов. При химическом синтезе вместе с целевым полноразмерным продуктом могут образовываться многочисленные родственные примеси.

В рассматриваемой работе отдельно выделяются:

• shortmers — укороченные последовательности, обычно обозначаемые как n−x;
• longmers — удлинённые продукты, например n+1 и n+2;
• полноразмерные последовательности с химическими модификациями;
• продукты последующей деградации.

Наиболее распространённые n−x примеси могут возникать при неудачном присоединении очередного основания и неполном блокировании реакционноспособной цепи.

Поэтому контроль олигонуклеотида — это не только определение основного вещества. Необходимо отличать большое количество структурно близких соединений, часть которых присутствует на очень низком уровне.

Почему используется IP-RP LC-MS

Одним из распространённых подходов к анализу олигонуклеотидов является ион-парная обращённо-фазовая жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием — IP-RP LC-MS.

Обычный MS1-анализ позволяет подтвердить интактную массу олигонуклеотида и некоторых примесей, однако значительно хуже подходит для установления положения отдельных модификаций или определения точной структуры сложной примеси.

В рассматриваемой работе эту задачу решали сочетанием:

• UHPLC-разделения;
• high-resolution accurate mass, HRAM;
• data-dependent tandem MS, ddMS2;
• специализированной обработки результатов.

Такой подход позволяет не только наблюдать соединение, но и получать информацию о его фрагментации и структуре.

Экспериментальная система

Для хроматографического разделения использовались:

• Vanquish Horizon UHPLC;
• DNAPac RP, 4 µm, 2.1 × 50 mm;
• Orbitrap Exploris 240;
• BioPharma Finder 4.0.

Исследуемым веществом был синтетический DNA 21mer:

CAG TCG ATT GTA CTG TAC TTA

Сравнивали два варианта одного и того же олигонуклеотида:

• после стандартного desalting;
• после HPLC-очистки.

Это особенно интересный эксперимент, поскольку позволяет непосредственно оценить, насколько ВЭЖХ-очистка изменяет профиль родственных примесей.

HPLC-очистка заметно уменьшила количество примесей

Это один из наиболее наглядных результатов статьи.

Суммарное содержание n−x примесей:

• 2.55% после стандартного desalting;
• 1.18% после HPLC purification.

При этом суммарная MS-площадь самого полноразмерного 21mer в двух образцах оставалась близкой.

То есть ВЭЖХ-очистка в данном эксперименте снизила относительное содержание укороченных продуктов более чем в два раза.

Особенно сильно уменьшилось содержание ряда коротких примесей; некоторые из них после HPLC-очистки уже не определялись в приведённой таблице.

Очень низкие концентрации примесей

Один из интересных примеров — примесь n−16 с относительным уровнем около 0.015%.

Она практически неразличима на общей хроматограмме, однако была идентифицирована по качественному MS2-спектру и карте фрагментации.

Это хорошо иллюстрирует ограничение оценки чистоты только по виду хроматограммы:

отсутствие заметного отдельного пика ещё не означает отсутствие структурно родственной примеси.

Что это означает для разработки ВЭЖХ-метода

Из этого Application Note можно сделать несколько практических выводов.

Первое: для олигонуклеотидов селективность колонки и ion-pair системы должны рассматриваться вместе.

Второе: даже при хорошем основном пике хроматограмма может скрывать низкоуровневые структурно близкие примеси.

Третье: при разработке метода важно проверять не только full-length product, но и:

• n−1;
• n−2;
• другие n−x;
• longmers;
• окисленные формы;
• продукты потери оснований;
• высокомолекулярные примеси.

Четвёртое: выбор колонки для олигонуклеотидов нельзя свести только к формальному признаку «RP-HPLC». Требуется экспериментальная оценка селективности для конкретной последовательности, состава ion-pair системы и целевых примесей.