Нормально-фазовая хроматография (Normal-Phase Chromatography, NP-HPLC)
06.09.2025HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) — важный тип хроматографии, особенно при анализе полярных и гидрофильных соединений, которые плохо удерживаются на обычных RP (обращенно-фазовых) колонках.
HILIC — это разновидность нормальной фазы, но работает по обратному градиенту элюирования, как в RP-HPLC: чем больше воды в подвижной фазе, тем быстрее элюируются вещества.
Принцип: удержание соединений за счёт взаимодействия с полярной неподвижной фазой и водным слоем, удерживаемым на её поверхности.
Используется высокое содержание органического растворителя (обычно 70–95% ацетонитрила) и небольшое количество воды (или буфера), образующего тонкую «гидратную плёнку».
- простые фазы на основе силанола или диола
- фазы с амино- или анионными связями
- амидные фазы
- ионообменные фазы
- цвиттерионные фазы
А в чем отличие HILIC от нормально-фазовой ВЭЖХ? Не вижу разницы!
Отличие HILIC от нормальной фазы (НФХ) действительно может показаться тонким, потому что обе используют полярные неподвижные фазы и неполярно-водоорганические подвижные фазы. Однако есть ключевые отличия в механизме удерживания, составе подвижной фазы и применении.
🔍 Ключевые отличия HILIC от нормальной фазы (НФХ)
| Характеристика | Нормально-фазовая хроматография (НФХ) | HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) |
|---|---|---|
| Тип неподвижной фазы | Полярная (силанол, NH₂, диол, циано и т.п.) | Полярная (чаще диол, амид, заряженные) |
| Подвижная фаза | Неполярный растворитель (гексан + этанол, ДХМ) | Органическая смесь с водой (например, MeCN + H₂O) |
| Полярность элюента | Низкая | Высокая (но органика — основной компонент) |
| Механизм удерживания | Адсорбция на поверхности (водородные связи, диполи) | Образование гидратной оболочки + водородные связи |
| Тип удерживаемых соединений | Удерживает полярные соединения | Удерживает очень полярные, ионогенные |
| Требования к растворимости | Растворение в неполярных растворителях | Растворимость в MeCN/H₂O |
| Совместимость с MS (ESI) | Ограниченная (низкая летучесть растворителей) | Высокая (MeCN — идеален для ESI) |
| Массовая доля воды | Минимальная или отсутствует | 5–40% воды (но MeCN — главный компонент) |
🧠 Простое объяснение
-
НФХ похожа на классическую химию разделения: у нас силикагель и неполярные растворители (как в ТСХ).
-
HILIC — это "гибрид": используется полярная колонка, но подвижная фаза больше похожа на RP (обращёнку), просто содержит мало воды.
💡 Механизм HILIC
-
Полярная неподвижная фаза удерживает на поверхности тонкий водный слой.
-
Аналиты растворяются в органике (MeCN), но перераспределяются между органикой и водным слоем (аналог RP-механизма, но наоборот).
-
Более полярные вещества лучше удерживаются.
Пример:
-
RP-HPLC: плохо удерживаются сахара, АТФ, аденозин.
-
HILIC: отлично разделяются полярные метаболиты, аминокислоты, сахара, нуклеозиды.
✅ Когда выбрать HILIC?
-
Вы анализируете очень полярные соединения, плохо удерживающиеся в RP.
-
Требуется высокая чувствительность в LC-MS (органические растворители летучи).
-
Вы работаете с биомолекулами, метаболитами, пептидами и т.п.
| Тип фазы | Функциональная группа | Механизм удерживания | Особенности применения | Примеры колонок и производителей |
|---|---|---|---|---|
| Простая силика (SiOH) | Свободные силанольные группы | Водородные связи, диполь–диполь | Классическая HILIC, универсальна | Phenomenex Luna HILIC, NUCLEODUR HILIC (Macherey-Nagel) |
| Амино (NH₂) | Аминопропил | Водородные связи, ионные взаимодействия | Хорошо для сахаров и амино кислот | YMC-Pack NH₂, Waters Spherisorb NH₂ |
| Диол (Diol) | 1,2-Дигидроксипропил | Водородные связи, гидрофильные взаимодействия | Для гидрофильных соединений, стабильна | Luna Diol (Phenomenex), ACE Diol |
| Заряженные (Zwitterionic, ZIC) | Сульфобетаин (–N⁺(CH₃)₂–CH₂–CH₂–SO₃⁻) | Ион-дипольные, электростатические | Высокая селективность для ионных и полярных веществ | Merck SeQuant ZIC-HILIC, TSKgel Amide-80 (Tosoh) |
| Амидные (Amide) | Амидные группы (–CONH₂) | Водородные связи, диполь–диполь | Для метаболитов, пептидов | Waters BEH Amide, Ascentis Express HILIC Amide |
| Циано (CN) | Цианопропил | Диполь–диполь, слабые водородные связи | Универсальная, мягкая полярность | Agilent Zorbax CN, Lichrospher CN |
