Как выбрать ВЭЖХ колонку?
06.08.2025C18 ВЭЖХ колонка (октадецилсилановые колонки): какие бывают?
08.08.2025Влияние органического растворителя (например, ацетонитрила) и буферной соли (например, формиат аммония, фосфат, TEAA, HFIP) на различные виды хроматографических фаз
| Тип хроматографии | Влияние органики (ацетонитрил, метанол) | Влияние буфера (pH, ионная сила, состав) |
|---|---|---|
| RP-HPLC | ↑ органика → ↓ время удерживания (менее полярные элюируют быстрее) | Буфер влияет на заряд веществ → селективность для ионизируемых соединений |
| NP-HPLC | ↑ органика (н-пентан, гексан) → ↑ удерживание полярных веществ | Обычно не используется; добавки (EtOH, IPA) как модификаторы |
| HILIC | ↑ органика → ↑ удерживание полярных соединений (особенно при ≥60%) | Буфер формирует водную оболочку → влияет на селективность, удерживание |
| HIC | ↑ органика → разрушает гидрофобные взаимодействия → ↓ удерживание | Соль (аммоний сульфат и др.) усиливает гидрофобные взаимодействия |
| IEC | Органика минимально влияет (при <20%) или разрушает ионообмен | Ионная сила и pH критичны: регулируют заряд ионов и удерживание |
| Mixed-Mode | ↑ органика → ослабляет гидрофобные взаимодействия | Буфер регулирует ионные взаимодействия (cation/anion exchange) |
| Affinity | Органика может нарушить специфичность связывания | Буфер обеспечивает специфические условия связывания/элюции |
| SEC / GPC | Органика влияет на растворимость образца (но не на разделение по размеру) | Буфер/соль регулируют ионные взаимодействия, уменьшая вторичные эффекты |
| Chiral | Органика влияет на элюирование энантиомеров (селективность зависит от фазы) | Буфер регулирует ионные взаимодействия (при наличии ионогенных групп) |
| Ion-Pair (IPC) | ↑ органика → ↓ удерживание при слабой ионной паре | Буфер и ион-парный реагент формируют гидрофобный комплекс с аналитом |
Примеры:
-
RP-HPLC: 70% ацетонитрил → парацетамол вымывается быстрее.
-
HILIC: 80% ацетонитрил + 20% 10 мМ формиат аммония → усиливает удерживание сахаров, нуклеотидов.
-
IEC: 0–1 М NaCl градиент → разделение белков по заряду.
-
Mixed-Mode: C18-WAX → 50% ACN ослабляет гидрофобные, но буфер 10 мМ ТЕАА сохраняет ионный обмен.
-
HIC: Высокая концентрация (1.5 М) сульфата аммония → белки удерживаются, а затем элюируются градиентом уменьшения соли.
-
IPC: Добавление HFIP + TEA к RP-фазе → эффективное удерживание фосфорилированных олигонуклеотидов.
Вот пример таблицы, в которой показано влияние состава подвижной фазы — органики (ацетонитрил) и буфера — на поведение смеси двух соединений на разных типах хроматографических фаз.
📌 Пример: смесь
-
Парацетамол (умеренно полярное, без заряда)
-
Аденозинмонофосфат (AMP) (ионное, сильно полярное)
🧪 Условия:
-
Буфер: формиат аммония / ацетат аммония
-
Органика: ацетонитрил (ACN), варьируем от 5 до 95%
-
Контролируем pH в диапазоне (3–7)
-
Температура: 30 °C
📊 Влияние состава подвижной фазы на элюирование и разделение:
| Тип фазы | Эффект увеличения % ацетонитрила | Эффект увеличения концентрации буфера | Замечания по поведению AMP и парацетамола |
|---|---|---|---|
| RP-HPLC (C18) | Ускорение вымывания обоих (особенно парацетамола). Уменьшение времени удерживания | Снижение ионных взаимодействий → быстрее уходит AMP | AMP удерживается хуже (менее гидрофобный), парацетамол — лучше. Высокая органика = оба быстро вымываются |
| NP-HPLC | Увеличение % ACN = ↑ удерживание (более полярная среда) | Малоэффективно без полярного протонного растворителя | Парацетамол и AMP слабо удерживаются — неэффективный режим |
| HILIC | Увеличение ACN = ↑ удерживание полярных (AMP). Парацетамол удерживается умеренно | Увеличение буфера снижает ионные взаимодействия → ускорение элюирования AMP | AMP сильно удерживается при высокой органике. Парацетамол — меньше |
| HIC (гидрофобный носитель + соль) | ACN нарушает водную матрицу → ↓ удерживание | Буфер = соль, ↑ концентрация = ↑ удерживание | Только в водной/солёной среде. Неприменим для AMP |
| IEC (WAX/SCX) | ACN снижает эффективность, нарушая водную фазу | ↑ буфера → ↑ ионообменная конкуренция → ↓ удержание | AMP удерживается сильно. Парацетамол — не удерживается |
| Mixed-Mode (C18 + WAX) | ACN уменьшает гидрофобный вклад, но может влиять на заряд | Буфер экранирует ионные взаимодействия | Разделение можно «тюнинговать» – AMP на WAX, парацетамол на C18 |
| Affinity | ACN может денатурировать белок-лиганд | Буфер поддерживает структуру белка, pH критичен | Только для специфичных взаимодействий. Здесь не применяется |
| SEC/GPC | ACN может "забить" поры | Буфер мало влияет | Нет различий — разделение только по размеру |
| Chiral | ACN влияет на подвижную фазу, может мешать хиральному взаимодействию | Буфер может улучшить взаимодействие | Неактуально здесь: оба соединения — ахиральные или неразличимы |
| Ion-Pair (IPC) | ACN уменьшает объем гидрофобного взаимодействия | ↑ буфера/ион-пар → ↑ удерживание AMP | AMP может элюироваться как неполярное, если ион-пар подобран правильно |
🔍 Выводы по паре:
| Условие | Поведение AMP | Поведение парацетамола | Лучшее разделение |
|---|---|---|---|
| RP-HPLC + ион-парник | Умеренное удерживание | Хорошее удерживание | Среднее, зависит от градиента |
| HILIC + ACN 85% | Сильное удерживание | Умеренное удерживание | Хорошее, особенно при тонкой настройке буфера |
| Mixed-mode C18-WAX | Ионный + гидрофобный контроль | Только гидрофобный | Отличное, селективное управление |
