Какие виды ВЭЖХ колонок существуют? Классификация ВЭЖХ по типу фаз и режимов
06.08.2025Как регулировать состав подвижной фазы в ВЭЖХ?
06.08.20251
Определите тип аналитов
-
Молекулярная масса, полярность, наличие заряженных групп
-
Специфические свойства (хиральность, метки, фосфолипиды)
2
Выберите режим разделения
-
RP-HPLC — неполярные/умеренно полярные аналиты
-
NP-HPLC — полярные гидрофобные вещества (углеводы, липиды)
-
HILIC — очень полярные метаболиты, нуклеотиды
-
IEC — ионные соединения
-
Mixed-Mode — амфифильные, смешанные по полярности и заряду
-
Специализированные (Chiral, SEC, Affinity, HIC, IPC)
3
Подбор стационарной фазы
-
RP: C18, C8, фенил, CN, PFP
-
NP: SiOH, NH₂, диол
-
HILIC: амид, ZIC, диол, CN, NH₂
-
IEC: –SO₃⁻ (анион), –NR₃⁺ (катион)
-
Mixed-Mode: RP+IEX или NP+IEX
4
Эндкеппинг и модификации
- Эндкеппинг (TMS или полярный)
- Полярные внедрённые группы (polar embedded)
- Aqua/HILIC-модификации для работы в воде
5
Выбор размеров частицы и пор
-
Частицы 1.7–3 µм для UHPLC (острые пики, лучшее разделение), 3–5 µм для классики
-
Поры 100–120 Å для малых молекул, 300–500 Å для белков/пептидов
6
Определите геометрию колонки
-
Диаметр 2.1 мм (низкий расход элюентов, узкие пики, но малая загрузка пробы) или 4.6 мм (универсально)
-
Длина 50–100 мм (быстро) или 150–250 мм (лучше разделение близких пиков)
7
Учтите рабочие условия
-
Давление системы (для мелкодисперсных колонок)
-
Диапазон pH (классический силикагель vs. гибрид)
-
Температурная стабильность (HTLC, монолитные колонки)
8
Совместимость с детектором
-
Совместимость с LC-MS (летучие буферы, малое содержание соли)
-
УФ-прозрачность носителя
9
Тестирование и валидация
- Проведите тест на пробах: пиковая форма, разрешение, воспроизводимость
- Оптимизируйте градиент/скорость потока, подбор растворителей
Анализ малой гидрофобной молекулы (например, парацетамол)
-
Тип аналита
– Молекулярная масса ≈151 Da, умеренно полярный, без заряженных групп. Гидроксильная (–OH) и амидная (–NH–CO–) фрагменты создают полярность, но при pH 2–8 не протонируются и не депротонируются в значимой степени → молекула остаётся нейтральной. -
Режим
– RP-HPLC (гидрофобное удерживание) или – Mixed-Mode WAX (даст дополнительную селективность по побочным веществам и примесям)
-
Стационарная фаза
– C18, эндкеппинг TMS или Mixed-Mode WAX -
Размер частицы и пор
– 5 µм, поры 100 Å. -
Геометрия
– Диаметр 4.6 мм, длина 150 мм. -
Рабочие условия
– Поток 1.0 мл/мин, давление до 300 бар, температура 30 °C.
– Подвижная фаза: вода+ 0.1% TFA/ACN или вода+10мМ AmAc, pH 5.5/ACN -
Эндкеппинг и модификации
– Классический TMS-эндкеппинг. Гидрофобное (RP) — взаимодействие с C18-участками. Слабый анионит (WAX) — отталкивание нейтрального парацетамола и удержание более кислых примесей. Пиковая форма парацетамола останется острой, кислые ионы (п-аминoфенол, примеси фенольного ряда) будут «удержаны» сильнее. -
Детектор
– UV-детектор при 254 нм. - Тест и валидация
– Оценка пиковой формы, RSD удерживания < 1%, разрешение от примеси > 2.
Пример анализа 35-мер олигонуклеотида с флюоресцентной меткой
Вариант 1 (классический). Ион-парный RP-HPLC
C18, 2.1×100 мм, 2.5 μм (C18 с высокоэффективной оболочкой).
-
A: 100 мМ (TEAA) в воде, pH ≈7.0
-
B: ацетонитрил
Принцип удерживания:
-
TEAA образует ионную пару с фосфатной группой олигонуклеотида, делая его нейтральным
-
Затем олиг- удерживается гидрофобной C18 поверхностью
Ожидаемые результаты и преимущества:
-
Чёткое разделение целевого 35-мерного олиго от n–1/ n+1 побочных продуктов
-
Острые, симметричные пики при оптимальном градиенте
| Способ управления | Эффект на ион-парное взаимодействие | Эффект на C18 (гидрофобное удержание) | Пример применения |
|---|---|---|---|
| Концентрация ИПР | ↑ ИПР → ↑ удержание заряженных аналитов | Увеличивает общую гидрофобность фазы, может задерживать даже неполярные соединения | 5 мМ → слабое, 100 мМ → сильное удержание |
| Длина цепи ИПР | Длиннее цепь → сильнее удержание | Длинноцепочечные ИПР (C4–C18) сильно увеличивают гидрофобность C18-фазы | TBA (C4), THA (C6), TPA (C8), HDA (C12) |
| pH подвижной фазы | Влияет на заряд аналитика и степень ионизации ИПР | При pH выше pKa кислоты – она ионизирована и вступает в ионную пару | Для кислот: pH < 3 → нет удержания, pH > 4 → появляется |
| % органического растворителя (ACN/MeOH) | ↑ ACN → ↓ ион-парное удержание (электростатические взаимодействия ослабляются) | ↑ ACN → ↓ удержание на C18 | 10 % ACN → сильное удержание, 50 % ACN → слабое |
| Тип буфера | Влияет на pH и ионную силу | Может конкурировать с ИПР за активные центры; ацетат/формиат — мягкие | Аммоний-ацетат предпочтительнее фосфатов в масс-спектрометрии |
| Температура | Уменьшает прочность ионных пар | Ускоряет массоперенос, снижает общее удержание | 25–60 °C оптимум |
Вариант 2 (специфический). Mixed-Mode WAX
Стационарная фаза: гидрофобные цепочки + третичный амин (слабый анионит WAX).
-
A: 10 мМ (AmFm) в воде, pH ≈6.0
-
B: ацетонитрил
-
Почему это работает:
-
WAX захватывает отрицательно заряженный фосфатный остов олиго-, усиливая селективность по сравнению с чистым RP. WAX — слабые основания, они протонированы, а при повышении pH депротонируются — ионный обмен выключается, остаётся только гидрофобное RP-удерживание.
-
Гидрофобные участки обеспечивают острое гидрофобное удерживание красящих меток.
-
Олигонуклеотид элюируется при снижении силы ионного обмена по градиенту органики, давая отличное разделение n–1/ n+1 продуктов и чистый пик целевого 35-мерного олиго.
- Чем выше концентрация соли в буфере (например, 10–100 мМ и более), тем слабее анионное удерживание.
- Увеличение органики обычно уменьшает удерживание, т.к. способствует ослаблению гидратного слоя.
-
| Способ | Эффект на WAX (анионный обмен) | Эффект на C18 (гидрофобное удержание) | Пример применения |
| Повышение pH | Снижает протонирование аминов, снижает удержание анионов | Незначительно уменьшает гидрофобность | Повышение рН → регулировка времени удерживания |
| Увеличение соли | Экранирует заряды, ослабляет ионный обмен | Немного ослабляет гидрофобное удержание (за счёт конкуренции за адсорбционные центры) | 10 мМ → сильное удержание, 100 мМ → слабое удержание |
| Изменение % органики | Увеличивам органику — снижам электростатические взаимодействия | 5–30 % ACN → высокая селективность | |
| Выбор буфера | Влияет на pH и силу ионного обмена | Слегка меняет гидрофобность (например, органические кислоты могут влиять на поверхность) | Аммоний-формиат vs аммоний-ацетат |
| Температура | Незначительно уменьшает электростатические силы | Увеличивает кинетику и слегка снижает гидрофобное удержание (ускоряет элюирование) | 25–50 °C оптимально |
Mixed-mode метод объединяет преимущества ионного и гидрофобного разделения в одной колонке и позволяет обойтись без двух независимых анализов RP и IEC.
Вариант 3. HILIC
Amide, 2.1×100 мм, 1.7 µм
Подвижная фаза:
-
A: ацетонитрил с 10 мМ аммоний-формиатом (pH ≈ 6.8)
-
B: вода с 10 мМ аммоний-формиатом (pH ≈ 6.8)
Что можно ожидать:
-
Чёткое разделение 35-мерного олиго от его n–1/ n+1-аналитов за счёт разницы числа фосфатных групп и длины гидратного слоя.
-
Высокую воспроизводимость Rt (RSD ≤ 1 %) и острые, симметричные пики.
-
Отличную совместимость с MS благодаря минимальному содержанию соли и высокой доле органики.
Когда HILIC не подойдёт:
-
Если ваш краситель слишком гидрофобен и «срывается» с колонки сразу.
-
Если нужно максимально быстрое время прогона (< 5 мин)—тогда лучше рассмотреть RP/IPC или mixed-mode.
